微生物培養是微生物科學研究和工業應用領域的重要基礎，廣泛應用于微生物的分離、鑒定、分析、篩選、馴化、適應性進化、菌株改造等方面。然而，傳統微生物培養方法主要以試管、搖瓶、固體平板為培養容器，輔以搖床、分光光度計、酶標儀等設備進行微生物的培養、檢測和篩選，存在操作繁瑣、效率低、耗時、耗力、耗物等問題。近年發展起來的高通量培養手段主要是以微孔板為容器建立起來的培養篩選體系，但微孔板一方面溶氧水平低，混合效果差、蒸發效應和熱效應比較嚴重，常常導致菌種生長狀況差，且差異性大；另一方面需要配套昂貴的設備，如移液工作站、酶標儀等，才能實現自動化培養和過程檢測。

液滴微流控作為微流控技術的重要分支，是近年來在傳統連續流微流控系統基礎上發展起來的，利用互不相溶的兩液相產生分散的微液滴并對微液滴進行操作的非連續流微流控技術[7]。微液滴具有體積小、比表面積大，獨立無交叉污染等特點，再結合液滴可控性強、通量高等優勢，已經有研究將其用于微生物的高通量培養、馴化、篩選等方面，展現出重要的應用潛力。然而，液滴微流控從實驗室技術走向應用推廣仍然存在一系列關鍵問題。首先，液滴微流控操作繁瑣精細，技術要求和門檻高；其次，液滴微流控技術涉及光、機、電的元部件聯合使用，且需要和生物技術應用場景結合，如果沒有多學科交叉協作，一般單個實驗室或團隊難以搭建高效的液滴微流控系統，從而無法開展液滴在微生物技術中的廣泛應用研究；再次，由于液滴體積極小(皮升–微升)，面向微生物傳代、進化和分選的等基本操作的自動化液滴精確操控與實時在線檢測實現難度大，難以形成一體化裝備系統。

液滴發生

基于微流控芯片的液滴發生技術常見的有3種，分別為流動聚焦法、十字通道法、T形通道法，并且常常通過調節油相和水相的進樣流速來控制生成液滴的大小。但由于芯片加工通常存在批次間誤差以及水相粘度差異等問題，不同芯片往往需要調整油相和水相的流速參數，才能形成穩定的微液滴，這些問題一直是微流控芯片應用于微生物培養的關鍵技術挑戰。如何低成本地設計能夠兼容芯片批次間誤差和樣品粘度差異等實際情況，且可以高精度地對液滴進行操作的芯片系統成為關鍵。考慮到T形通道結構簡單易加工、成本較低，本研究將該結構引入芯片設計中。為了克服芯片批次誤差和樣品粘度差異等問題，采用獨特的油相和水相間歇順次驅動進樣方法，進而在芯片中生成體積大小精確可控的微液滴(圖 4A)，并通過巧妙串聯使用T形結構通道，可以生成濃度梯度不同且精確可控的微液滴(圖 4B)。

圖 4 液滴操作系統：(A：液滴發生；B：多濃度梯度液滴發生；C：液滴分割融合；D：液滴分選)

液滴培養

微生物培養過程通常需要提供合適的溫度、氧氣等條件。基于微流控的好氧微生物培養，常常用透氣性良好的PDMS作為芯片材質，輔以環境溫度控制，來滿足微生物的生長需求。但是PDMS具有柔性較大、易形變等特點，給液滴的精確穩定操作帶來了極大的負面影響，所以不適合用于本研究。因此，如何既能夠實現液滴培養的氣體交換，又具備良好剛性和光學性能的芯片系統成為微生物微液滴培養的關鍵。而從目前已開發的芯片材質分析，透氣性和剛性往往不可兼得。為此，本研究提出了將液滴操作和液滴培養兩個過程分離的思路，即利用剛性強、光學性能優的材料加工微流控芯片，利用透氣性強、變形性小的微管路作為液滴培養的容器，實現硬質芯片與透氣培養管路的有機結合，成功解決了微生物微液滴培養的難題。液滴在系統運行過程中，不斷往復于培養管路之中，進而充分滿足培養過程中氣體交換的需求。

 液滴分割融合

微生物的傳代培養操作中，需要將培養到一定階段的菌懸液取出一部分，接種到新培養基中，繼續進行傳代培養。在本研究需要實現將已培養的微生物微液滴向新培養基液滴中接種菌液，實現基于微液滴的微生物傳代培養操作。傳統的液滴分割融合方式常常利用芯片結構對已培養的所有母液滴進行分割，生成兩個子液滴，其中一個子液滴則直接從廢液口排出，待所有液滴完成分割后，再將所有待利用的子液滴與新培養基液滴進行融合，從而完成液滴的微生物傳代。但在對已培養的母液滴進行分割處理中，往往存在液滴的識別和驅動過程誤差，造成液滴切割融合的精確性下降，而長期多次操作會進一步導致單次操作誤差的累積，造成最終的液滴體積差異過大，穩定性差等問題。另外，如果分割后的子液滴體積較小，則其在往復運動過程中容易發生相互融合，影響系統穩定性。如何能夠精確實現液滴分割融合操作、避免誤差累積、降低液滴之間融合風險、提高系統運行穩定性成為液滴傳代操作的關鍵。為解決液滴分割融合誤差的問題，本研究創造性地提出“掐頭去尾”式的液滴分割融合新方法(圖 4C)，即液滴經過識別點時，液滴體積的大部分停留在注入通道中，通過推動主通道中油相流動，對駐留液滴暴露在主通道中的小部分頭部體積部分進行切割，將液滴分割成兩部分，頭部液滴部分被推入廢液通道，另一部分則停留在駐留通道中；此時，將新培養基液滴推動至液滴注入通道口處，然后將被切割液滴定量進入新液滴，再次推動融合后的液滴離開注入通道口，而殘余的液滴尾部則也被推入至廢液中。同時，這種巧妙的液滴操作方式，使得液滴的分割和融合過程緊密相連，避免了小體積液滴長時間運行而可能造成的相互融合，極大提高了微液滴系統運行的穩定性。

液滴分選

液滴從生成開始，通過液滴識別系統對每個液滴進行編號，每個液滴的所有檢測數據都會與對應編號的液滴進行匹配，因此在分選操作實施前，液滴經過識別點進行編號識別，根據培養過程微液滴OD檢測數據，如果是所需液滴，就會通過閥口，收集至收集管中，如果是廢棄液滴則被推入下游管路，繼續下一個液滴的分選處理(圖 4D)，進而實現目標微生物微液滴的分選。

芯片集成化設計

在實現微液滴發生、培養、分割融合、監測、分選的基礎之上，本研究對這些功能結構進行了系統集成，形成了功能完備的集成化微流控芯片系統(圖 5)。其中2號、4號、6號與進樣瓶相連，分別用以盛放種子液、新鮮培養基、化學因子母液。1號、3號、5號均是油相通道，直接與注射泵相連。1號、3號管路為長度為2 m的透氣性良好的AF-2400材質管路(內徑=1 mm，外徑=1.6 mm)，液滴在兩者之間進行往復運動。廢液管與閥相連，用以排出廢液。芯片中的液滴識別點、光譜檢測點則分別作為液滴識別窗口和光譜檢測窗口。芯片系統整體置于恒溫控制倉中，保證微生物培養提供所需的最適溫度。

集成化微流控芯片系統結構示意圖

液滴微流控技術因生成的液滴體積小、通量高、質能交換快、可獨立操作等特性為微生物研究提供了新方法，但其操作要求高、影響因素多、缺乏自動化集成等問題限制了該技術的應用推廣。本研究針對上述關鍵難題，通過設計開發液滴識別功能模塊、液滴檢測模塊、進樣模塊以及芯片模塊等，將液滴的發生、培養、檢測、分割、融合、分選等多種復雜操作進行有機集成，成功研制出了一款全自動高通量微生物微液滴培養系統(MMC)，形成了小型化、自動化、高通量的微生物培養系統，并且操作簡單，運行穩定。相比于傳統的微生物高通量培養裝備，MMC具有物料消耗少、操作簡單、在線檢測(OD和熒光)、數據采集密度大、普適性強等多種優勢。

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