基于液滴模式的微流控細胞篩選系統

自2001年Quake研究組提出液滴微流控的概念以來,液滴微流控技術得到了長足發展,在高通量藥物篩選領域也得到了廣泛應用。基于液滴模式的微流控系統利用互不相溶的兩相形成pL至nL級包裹細胞的液滴,在液滴中完成細胞的培養和對細胞的藥物刺激等操作。這類系統可以在短時間內形成大量細胞液滴,提高實驗的通量,并可有效降低試劑的消耗量,但液滴反應器的使用同時也對液滴內營養物質的更新和細胞代謝物的清理提出了挑戰。

Clausell-Tormos等首次建立了可實現細胞生長的液滴微流控系統,以添加了表面活性劑的氟油(FC40)為連續相(continuous phase),細胞懸浮液為分散相(dispersed phase),生成了FC40包裹的細胞液滴。FC40具有良好的生物兼容性和透氣性,因此能夠使得細胞在液滴中正常生長。該研究組分別以白血病T細胞(jurkat)和腎細胞(HEK293T)作為懸液細胞和貼壁細胞的代表,證明了即使在液滴體積僅為660 pL的條件下,3 d后細胞的存活率仍能達到80%。

除了產生大小均一的液滴,能夠對液滴進行精準操控是實現細胞分析的必要條件。Brouzes等構建了一種集成化的液滴微流控系統,用于高通量單細胞藥物篩選(見圖4a)。首先利用光學編碼技術對不同的藥物液滴進行標記,形成化合物庫,再在電場的作用下將藥物液滴和單細胞液滴順序融合、收集,孵育24 h后將其重新注入微流控芯片中,并將其與含有細胞活性分析試劑的液滴再次融合,對藥物刺激結果進行檢測分析。Kulesa等同樣利用電場融合液滴的方法設計了一套適用于組合藥物篩選的微流控芯片系統。在該系統中,細胞懸浮液、不同的藥物溶液和特異性熒光染料被預先混合并乳化為液滴,這種熒光染料能夠分別在不同的激發光下實現對藥物的識別和細胞活性的檢測。之后將得到的液滴注入PDMS微坑芯片中,由于微坑的獨特結構,每個微坑能夠同時捕獲兩個液滴,兩個隨機被捕獲的液滴在電場作用下融合,進行藥物對細胞的刺激實驗(見圖4b)。利用該系統評估了4000多種藥物與10種抗生素對大腸桿菌(Escherichia coli)的聯合作用,成功發現了多種之前未被報道的協同組合。Wong等設計了一種PDMS通道芯片,用于形成細胞液滴進行藥物篩選(見圖4c)。

圖 4   基于液滴模式的微流控細胞篩選系統

每個單通道包含48個細胞培養腔室,當細胞樣品從通道入口流入時,由于腔室(well)之后通道(restriction)的限制壓力,流體只能進入腔室區域和旁路通道(bypass);隨后再通入油相,由于腔室之前通道(neck)的限制壓力,油相無法進入腔室,從而截斷流體,即可依次在腔室中形成細胞液滴。在該系統中,一個通道中平均截留80000個細胞,用以篩選5種藥物作用條件,對于貼壁細胞和懸浮細胞均可適用,可實現在腫瘤切除24 h內,快速、低成本地篩查原發性腫瘤癌細胞。

為了更好地模擬體內腫瘤細胞,目前已經發展了多種基于3D細胞培養的液滴微流控系統。Wang等將HeLa細胞包裹在由藻酸鹽和基質膠混合得到的水凝膠液滴中,形成細胞球(見圖5a),之后使用長春新堿(vincristine)對細胞球進行刺激。實驗結果表明,相比于傳統單層培養的細胞,腫瘤細胞球具有更明顯的耐藥性。Sun等開發了一種生成具有核-殼結構的藻酸鹽微粒的方法,之后將乳腺癌細胞(MCF-7)和成纖維細胞(human mammary fibroblasts)分別封裝在藻酸鹽微粒的核與殼中,建立3D共培養的腫瘤模型,模擬體內微小的腫瘤組織(見圖5b)。利用該共培養腫瘤球體測定了姜黃素和紫杉醇(paclitaxel)兩種抗癌藥物的細胞毒性,顯示出與常規孔板方法結果相似的腫瘤球耐藥性。該方法可快速形成大小一致但組成不同的各種腫瘤球體,應用于大規模抗腫瘤藥物的篩選,同時也為細胞的共培養模式提供了新思路。作者所在研究組發展了一種在PDMS基片的側壁上形成細胞球的方法,通過序控液滴陣列(SODA)技術控制毛細管探針在基片側壁依次形成細胞懸液的懸滴,并穩定地附著在側壁上,最終培養形成了HepG2細胞球,并完成了阿霉素對細胞球的刺激實驗(見圖5c)。這種方法的優點在于不僅可以實現細胞的3D培養,還使得懸滴的上方和下方均處于開放的狀態,可以方便地完成后續的藥物加入、細胞染色以及細胞觀察等操作。

圖 5   基于3D細胞培養的液滴模式微流控細胞篩選系統

基于微陣列模式的微流控細胞篩選系統

基于微陣列模式的微流控細胞篩選系統是指在能夠適應細胞培養的載體上,通過一定的手段生成細胞液滴陣列,并對細胞液滴陣列進行操控和分析。這類系統能夠通過擴大液滴陣列的規模在單次實驗中同時篩選大量不同的樣品,而且容易實現對細胞液滴陣列的整體操控以提高篩選效率,但同時這些操作的實現也依賴于高精度且配套的液體操控設備。

Lee等構建了一種名為水凝膠液滴陣列(DataChip)的微陣列芯片系統(見圖6a),并應用于高通量藥物篩選實驗中。首先利用凝膠打印機在經過處理的玻璃表面生成含有乳腺癌細胞(MCF-7)的水凝膠液滴陣列進行孵育培養,然后將預先制備的藥物凝膠陣列(MetaChip)貼合于細胞凝膠陣列上完成藥物刺激實驗。該系統最多可集成1080個不同條件的液滴陣列,藥篩結果與傳統的基于96孔板的方法所得到的實驗結果相近,但藥物消耗量可以降低約2000倍。之后該研究組還提出了通過在微柱陣列芯片的微柱上形成水凝膠細胞液滴用于藥物篩選的方法。

圖 6   基于微陣列模式的微流控細胞篩選系統

微坑陣列因為易于加工、通量高,在形成細胞液滴陣列上應用非常廣泛。Wu等[68]利用聚乙二醇(PEG)微坑陣列芯片和PDMS微柱陣列芯片構建了一種夾心結構的微流控細胞篩選系統(見圖6b)。先通過點樣儀將不同的藥物沉積在PDMS微柱陣列上,之后插入接種了細胞的PEG微坑中,實現對細胞的藥物刺激。盡管該微坑/微柱陣列芯片僅為普通載玻片大小,但單次可完成2100個測定。利用該系統測試了320種天然化合物對乳腺癌細胞(MCF-7)的化學毒性,還進行了P-糖蛋白(P-glycoprotein)與天然化合物的組合檢測,成功篩選出能夠增強對MCF-7細胞抑制作用的組合。Li等設計了類似的微坑/微柱結構裝置。直接以1536孔板提供微坑,制備互補的PDMS微柱,并將其連接到1536孔板的板蓋上,加藥時翻轉板蓋對準孔板使微柱插入孔中。通過熒光檢測藥物與乳腺癌細胞(MDA-MB-231)的相互作用,獲得了抑制MDA-MB-231細胞活性的先導單一藥物以及具有協同作用的藥物組合。Chong等設計了一種由同心細胞腔室單元組成的微坑陣列芯片,用于細胞的共培養(見圖6c)。每個同心細胞腔室單元由中心腔室和環形腔室組成。肝細胞球體(HepaRG)和U937免疫細胞分別被接種在中心腔室和環形腔室中,經過肝代謝后的活性代謝物通過腔室之間的微通道擴散至鄰近的免疫腔室中。通過檢測免疫細胞的活化程度,測試了3種藥物的致敏性,表明了與傳統細胞遷移腔室(Transwell)培養方式相比,該芯片可以更好地區分皮膚過敏的致敏藥物和非致敏藥物。

利用表面張力來形成細胞液滴陣列也是常用的一種方法。通常會選擇對芯片表面進行選擇性修飾,改變芯片表面特定區域的親疏水性質,使得細胞懸液被截留在特定區域,從而形成細胞液滴陣列。Popova等開發了一種形成超疏水-超親水微圖案的方法。利用超疏水和超親水區域的潤濕性差別,自發地形成細胞液滴陣列(見圖6d)。通過在這些獨立的液滴中進行細胞培養,再加入不同的藥物試劑,實現對細胞的高通量分析。Zhang等制備了一種由PDMS微坑陣列和超疏水聚合物層組成的超疏水微坑陣列芯片。除了能用來接種細胞液滴,還可以快速實現整個液滴陣列的培養基更換,因此該系統兼容于貼壁細胞和懸浮細胞。

作者所在研究組也將SODA技術應用于構建細胞液滴陣列中,發展了一種基于細胞液滴微陣列的藥物篩選系統。得益于SODA技術對液體的靈活操控能力(包括液體的量取、吸取、轉移、注射、混合等),該系統在一塊PDMS芯片上完成了藥物篩選過程所需要的全部操作步驟,包括細胞接種、第一個藥物刺激、第二個藥物刺激、細胞熒光標記等。采用每24 h更換一次細胞液滴培養基的方法,在覆蓋了氟油(FC40)的500 nL液滴中完成了長達11 d的細胞培養。該系統被應用于3種抗癌藥物黃酮哌啶醇(flavopiridol)、紫杉醇和5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)對A549細胞的藥物聯用組合篩選中(見圖6e),得到了產生最佳抑制效率的藥物組合。

總結與展望

高通量藥物篩選是現階段藥物開發的主要途徑。微流控技術的出現使生化反應可以在微加工的通道、腔室或nL級甚至是pL級的液滴中進行,這在很大程度上改變了傳統高通量篩選系統的工作模式,引起了人們的廣泛關注,使得基于微流控技術的細胞篩選系統得到了快速發展,展現出突出的研究潛力和應用價值。

盡管微流控技術在試劑消耗、篩選通量、細胞培養微環境控制等方面與常規方法相比已經展現出明顯的優勢,但仍然有很大的發展空間。目前文獻報道的大部分微流控細胞水平高通量藥物篩選系統仍處于實驗室研究階段,尚未達到商品化和通用化的程度。多數系統還難以在超微量和高通量水平下,完成從細胞陣列的形成、培養到加藥和檢測等全過程操作的自動化。如何自動實現有限細胞的精準量取與分配,如何精準地控制批量微反應器內的細胞培養條件,如何自動實現大規模具有不同組成和濃度藥物的加入和刺激,以及如何自動實現篩選結果的快速高通量檢測等,是下一步在實現微流控細胞水平高通量藥物篩選系統實用化中應該重點解決的問題。此外,目前的微流控系統構建的細胞培養環境與實際體內細胞的微環境還有較大差距。為了能夠提高藥物篩選結果的準確性,目前研究者們已經不局限于傳統獨立細胞的培養模型,而是通過構建各種不同結構的器官芯片來進一步模擬人體組織和器官的功能,包括實現細胞的共培養、血液的流動以及物質的傳輸等,以此來提供一個更加接近人體真實生理和病理條件的研究模型,這也將是今后該領域的重點發展方向之一。

總之,微流控藥物篩選系統發展的最終目的是為了減少藥物開發過程中對動物實驗的需求,甚至是部分替代動物實驗,以促進更大規模、更高通量,同時更安全、更有效的藥物開發。雖然這還有很長的道路要走,但隨著微流控技術的快速發展,微流控細胞水平的高通量藥物篩選系統一定會得到進一步完善,實現更為強大和復雜的功能,成為推進全自動藥物開發的重要力量。

免責聲明：文章來源DOI: 10.3724/SP.J.1123.2020.07014  以傳播知識、有益學習和研究為宗旨。 轉載僅供參考學習及傳遞有用信息，版權歸原作者所有，如侵犯權益，請聯系刪除。