微液滴中的單細(xì)胞包封主要是通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)和表面張力操縱來(lái)實(shí)現(xiàn)的。液滴尺寸由連續(xù)相的粘度、界面張力、微通道尺寸以及分散相和連續(xù)相的流速?zèng)Q定，液滴直徑從幾十微米到幾百微米不等。單細(xì)胞微滴具有高通量和小尺寸的特點(diǎn)，使其適用于高通量單細(xì)胞分析。然而，單細(xì)胞的包封通常是隨機(jī)的，特別是當(dāng)基于通常用于單細(xì)胞分析的被動(dòng)液滴生成方法時(shí)。需要加強(qiáng)對(duì)單細(xì)胞包囊的控制。為了提高實(shí)際應(yīng)用的封裝效率，通常會(huì)進(jìn)行隨機(jī)封裝，然后根據(jù)工藝要求進(jìn)行進(jìn)一步篩選。此外，通道結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)定制，以確保細(xì)胞的最佳排列和封裝。

隨機(jī)單細(xì)胞包封使用微流體液滴技術(shù)生產(chǎn)液滴面臨著一個(gè)固有的復(fù)雜性，即溶液中細(xì)胞的分布通常是不均勻的，包封是一個(gè)隨機(jī)過(guò)程。因此，無(wú)限稀釋的細(xì)胞懸浮液中每個(gè)液滴封裝的細(xì)胞數(shù)量將遵循泊松分布，其中液滴中的細(xì)胞數(shù)量由液滴的大小和懸浮液中細(xì)胞的密度決定。增加細(xì)胞密度或液滴大小會(huì)增加給定液滴包封多個(gè)細(xì)胞的機(jī)會(huì)。例如，在細(xì)胞懸浮液濃度為7.5×105個(gè)細(xì)胞/mL時(shí)，在體積為33、180、320 pL時(shí)，含有多個(gè)細(xì)胞的概率分別為0.03、0.83和2.45%（圖4A）。預(yù)測(cè)的泊松分布與液滴形成后獲得的實(shí)際分布非常一致。一般來(lái)說(shuō)，大多數(shù)液滴會(huì)有一個(gè)細(xì)胞或沒(méi)有細(xì)胞，只有少數(shù)液滴會(huì)包含多個(gè)細(xì)胞。隨機(jī)確定的包封在液滴內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量的變化將對(duì)研究單個(gè)細(xì)胞的能力產(chǎn)生重大影響。

在隨機(jī)包封方法中，每個(gè)液滴的細(xì)胞數(shù)量取決于細(xì)胞懸浮液的初始濃度和液滴體積，但將遵循高度隨機(jī)的分布，其中單細(xì)胞液滴的比例較低。因此，必須進(jìn)一步加強(qiáng)控制單個(gè)液滴內(nèi)包封的細(xì)胞數(shù)量的程度。為了提高單細(xì)胞包封的效率，一些研究人員采用了隨機(jī)包封后分選的方法。例如，Navi等人提出了一種使用流聚焦微流體裝置在水滴中產(chǎn)生水的方法。87在他們的裝置中，鐵磁流體被集成到全水滴微流體系統(tǒng)中，以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞包封和空液滴的抗磁性分離。與現(xiàn)有平臺(tái)相比，他們的平臺(tái)的主要優(yōu)勢(shì)是良好的生物相容性，不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，芯片簡(jiǎn)單易操作。通過(guò)使用反磁力來(lái)操縱細(xì)胞包封液滴，液滴不需要被磁化，因此細(xì)胞不會(huì)與磁性材料直接接觸，從而能夠以100%的分離純度進(jìn)行未標(biāo)記的細(xì)胞操作。這種簡(jiǎn)單且生物相容的微流體平臺(tái)非常適用于單細(xì)胞分析。此外，Nan等人引入了一種微流體系統(tǒng)來(lái)生產(chǎn)和分類單細(xì)胞微膠囊（圖4B），88通過(guò)該系統(tǒng)，他們能夠在微流體裝置中實(shí)現(xiàn)微滴和微凝膠的高通量制備。重要的是，芯片上的分選電極用于完成單細(xì)胞微膠囊的選擇，同時(shí)將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中。在每毫升3.05×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞密度和50μm的液滴直徑下，它們實(shí)現(xiàn)了16%的單細(xì)胞包封率。分選后，單細(xì)胞包封率提高到80%以上。該方法可用于整合液滴凝膠化、單細(xì)胞負(fù)載微凝膠分選和轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基中，以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞水平的高通量分析，從而全面評(píng)估細(xì)胞異質(zhì)性。最近，Shum的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種基于微流控液滴和熒光激活分選技術(shù)組合的按需液滴收集系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以連續(xù)定量地將所需的液滴收集到微管中，而不會(huì)造成明顯的樣品損失或微流控中斷（圖4C）。具體來(lái)說(shuō)，他們的方法允許在液滴產(chǎn)生后交替地對(duì)每個(gè)分支通道進(jìn)行分選、分布和收集，以實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞液滴的連續(xù)收集。然后將包封的單細(xì)胞液滴有效地捕獲在培養(yǎng)板上，并進(jìn)一步培養(yǎng)以研究細(xì)胞行為并充分分析單個(gè)細(xì)胞的特異性。通過(guò)使用熒光激活液滴分選和閥驅(qū)動(dòng)分配，該方法可以在200 Hz以上的頻率下篩選單個(gè)細(xì)胞，單個(gè)細(xì)胞的包封效率和回收率分別為98.5%和99%。這種方法比傳統(tǒng)的人工細(xì)胞選擇和激光捕獲顯微切割技術(shù)更有效，在單細(xì)胞水平分析任務(wù)中具有廣闊的應(yīng)用前景，如免疫學(xué)中的細(xì)胞因子檢測(cè)、蛋白質(zhì)組學(xué)中的質(zhì)譜和轉(zhuǎn)錄組的全基因組測(cè)序。

受控的單細(xì)胞包封如前所述，懸浮液中的細(xì)胞隨機(jī)包封成液滴的過(guò)程結(jié)果通常遵循泊松分布，這通常會(huì)導(dǎo)致相對(duì)較低的單細(xì)胞包封率。為了提高單細(xì)胞包封效率，可以在彎曲的微通道中使用慣性測(cè)序?qū)蝹€(gè)細(xì)胞包封在液滴中，通過(guò)將慣性力和Dean力均勻地結(jié)合到空間細(xì)胞的過(guò)程。通過(guò)將細(xì)胞流動(dòng)的周期性與液滴的產(chǎn)生相匹配，可以減少空液滴和多細(xì)胞液滴的數(shù)量，提高單細(xì)胞的包封效率。例如，Edd等人報(bào)道了高縱橫比微通道中液滴對(duì)單個(gè)細(xì)胞的順序包封。在他們的研究中，細(xì)胞自組織成兩股均勻間隔的流，單細(xì)胞直徑占通道寬度的一半以上。這確保了設(shè)計(jì)的通道寬度只能容納單行細(xì)胞，因此細(xì)胞進(jìn)入頻率與液滴產(chǎn)生頻率一致。這種方法可以通過(guò)克服泊松分布的固有局限性來(lái)有效地提高封裝精度，以確保幾乎每個(gè)液滴都包含一個(gè)細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)高封裝效率（97.9%).

Kemna等人率先使用Dean流形成單細(xì)胞排列，隨后進(jìn)行單細(xì)胞包封（圖4D）。 Dean流可以誘導(dǎo)細(xì)胞在平衡的位置聚集，以實(shí)現(xiàn)所需的空間排列，確保細(xì)胞流動(dòng)周期與液滴產(chǎn)生頻率一致，并將包封效率提高到77%。他們的方法利用微觀結(jié)構(gòu)來(lái)控制細(xì)胞的規(guī)則排列，然后完成單細(xì)胞的封裝，有效地提高了單細(xì)胞液滴的比例。然而，這不僅需要控制Dean流的形成，還需要細(xì)胞和液滴頻率的同步，這很難實(shí)現(xiàn)。

他的團(tuán)隊(duì)將螺旋和蛇形通道結(jié)合起來(lái)，有效地聚焦細(xì)胞和微珠。他們使用他們的方法包封條形碼微珠和人類小鼠細(xì)胞，然后通過(guò)測(cè)序表征細(xì)胞異質(zhì)性（圖4E）。使用這種方法，與傳統(tǒng)的Drop-seq設(shè)備和僅用于聚焦微珠的設(shè)備相比，他們的細(xì)胞利用率分別提高了300%和40%。結(jié)果支持其微流控芯片的操作效率得到提高。這種芯片設(shè)計(jì)具有實(shí)現(xiàn)高效單細(xì)胞表達(dá)譜的巨大潛力。

水凝膠中的單細(xì)胞包封

除了模擬三維（3D）微環(huán)境以支持細(xì)胞的活動(dòng)和功能外，將單細(xì)胞包裹在微尺度水凝膠中還可以作為進(jìn)行獨(dú)立細(xì)胞操作和監(jiān)測(cè)的良好工具，這對(duì)于探索類體內(nèi)微環(huán)境中的單細(xì)胞活動(dòng)至關(guān)重要。與單細(xì)胞包封的液滴不同，微凝膠可以形成3D網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其形態(tài)可以通過(guò)調(diào)節(jié)凝膠單體或聚合物的濃度來(lái)控制。這確保了氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子的供應(yīng)，以及細(xì)胞代謝廢物的及時(shí)排出，這使得在凝膠微球中培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)間成為可能。通過(guò)應(yīng)用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)或物理方法，液滴中的未固化凝膠可以被激活轉(zhuǎn)化為凝膠微球。化學(xué)凝膠化可以通過(guò)光誘導(dǎo)交聯(lián)、氧化還原誘導(dǎo)聚合或分子間化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。雖然通過(guò)化學(xué)凝膠化制備的水凝膠具有更高的穩(wěn)定性、更長(zhǎng)的耐用性和更好的機(jī)械性能，但使用化學(xué)交聯(lián)劑可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞毒性，一些化學(xué)反應(yīng)的低特異性可能會(huì)導(dǎo)致與蛋白質(zhì)和細(xì)胞的意外相互作用。物理凝膠化可以經(jīng)由熱介導(dǎo)的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變或離子之間的物理交聯(lián)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在熱產(chǎn)生的凝膠化過(guò)程中，當(dāng)溫度高于凝膠化溫度時(shí)，含有聚合物的液滴處于液態(tài)，將溫度降低到凝膠化溫度以下會(huì)導(dǎo)致聚合物的線性分子聚合。形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)液滴固化成凝膠微球。另一種凝膠化方法是基于靜電相互作用的物理交聯(lián)。一種常見(jiàn)的物理交聯(lián)凝膠化方法是通過(guò)藻酸鈉葡萄糖單元中的鈣離子和羧酸基團(tuán)的螯合將藻酸鈉轉(zhuǎn)化為藻酸鈣凝膠。雖然物理凝膠化過(guò)程可以在溫和的條件下進(jìn)行，但物理水凝膠網(wǎng)絡(luò)在組織內(nèi)的機(jī)械強(qiáng)度通常較低，穩(wěn)定性較差。因此，物理方法更適合包封細(xì)胞，并且比化學(xué)交聯(lián)方法具有更好的生物相容性。兩種類型的材料——合成聚合物和天然聚合物——用于生產(chǎn)包封單細(xì)胞的水凝膠微球。

使用合成聚合物進(jìn)行包封在微流控液滴技術(shù)中，合成聚合物被用作生產(chǎn)細(xì)胞包封凝膠微球的材料，該微球可以通過(guò)化學(xué)修飾直接控制細(xì)胞微環(huán)境。常用的合成聚合物包括聚（N-異丙基丙烯酰胺）和聚乙二醇二丙烯酸酯。合成聚合物在分子量、結(jié)構(gòu)和交聯(lián)密度方面具有可調(diào)節(jié)的性能，可用于生產(chǎn)具有不同機(jī)械性能的凝膠微球，通常比天然水凝膠更強(qiáng)。含有薄（幾微米）半滲透外殼的合成水凝膠膠囊與基因組擴(kuò)增等多步分子生物學(xué)檢測(cè)兼容。然而，這些合成微凝膠是不可生物降解的。

一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)紫外線聚合的合成聚合物被應(yīng)用于形成凝膠微球以包封細(xì)胞。含有光引發(fā)劑、交聯(lián)劑和單體的細(xì)胞懸浮液用作分散相。微滴在微流控芯片中產(chǎn)生后，光引發(fā)劑在紫外光照射下，在交聯(lián)劑的作用下促進(jìn)單體的交聯(lián)反應(yīng)，產(chǎn)生凝膠微球。Kamperman等人使用聚乙二醇二丙烯酸酯作為原料，在微流體流聚焦裝置中以1 kHz的包封速度形成包封有多能性人間充質(zhì)干細(xì)胞或牛軟骨細(xì)胞的微滴（圖5A）。通過(guò)下游通道中的外部紫外光源對(duì)微滴進(jìn)行光交聯(lián)，以制備細(xì)胞負(fù)載微凝膠并保持高細(xì)胞活性。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選的單細(xì)胞微凝膠（純度>90%）然后與聚乙二醇二丙烯酸酯和藻酸鹽等不同的生物相容性材料混合，以創(chuàng)建各種模塊化生物墨水，可用于3D打印，以單細(xì)胞分辨率重建細(xì)胞微環(huán)境。然而，紫外線照射對(duì)細(xì)胞有一些毒性作用。解決這個(gè)問(wèn)題有兩種潛在的方法：（1）可以減少紫外線照射的暴露時(shí)間或調(diào)整紫外線波長(zhǎng)；（2） 可以開(kāi)發(fā)新的聚合方法來(lái)避免細(xì)胞損傷。

使用天然聚合物進(jìn)行封裝與合成聚合物不同，天然聚合物來(lái)源于生物體自身產(chǎn)生的代謝物。近年來(lái)，天然聚合物因其良好的生物相容性和溫和的聚合條件而被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞封裝。用于單細(xì)胞包封的天然聚合物包括海藻酸鈉、瓊脂糖、明膠、膠原蛋白、和透明質(zhì)酸，其中海藻酸鈉，瓊脂糖和明膠是最常用的95種。

海藻酸鹽是一種從褐藻中提取的水溶性線性大分子多糖化合物，由不同比例的β-d-manuronic和α-l-古洛糖醛酸單元形成。108古洛糖核酸單元中的羧基可以與鈣、鋇和鎂等二價(jià)陽(yáng)離子反應(yīng)，導(dǎo)致快速凝膠形成。由于海藻酸鈉無(wú)毒，凝膠化模式溫和，生物相容性良好，因此通常用于制備凝膠微球來(lái)包封細(xì)胞，可應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、組織工程、藥物篩選和其他生物領(lǐng)域。一般來(lái)說(shuō)，有兩種方法可以控制海藻酸鈉的凝膠化過(guò)程：外部凝膠化，其中交聯(lián)劑擴(kuò)散到液滴外部；以及內(nèi)部凝膠化，其中交聯(lián)劑被加載到水相中并由刺激觸發(fā)。

Liao等人使用外部凝膠化將細(xì)胞包封在生物相容性海藻酸鈉液滴中，并將其包封在油滴中，形成基于雙流聚焦區(qū)域的雙乳液。油擴(kuò)散的Ca2+進(jìn)入海藻酸鈉形成微凝膠。盡管這種凝膠化方法有助于保持高細(xì)胞存活率，但由于鈣擴(kuò)散的困難，微凝膠無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)完全凝膠化。為了解決不完全凝膠化的問(wèn)題，研究人員提出了一種液滴融合方法來(lái)更好地制備單細(xì)胞微凝膠。Liu等人報(bào)道了一種基于微流控液滴技術(shù)制備單細(xì)胞微凝膠的新方法。他們使用含有2%海藻酸鈉或1%氯化鈣溶液的細(xì)胞懸浮液作為分散相，大豆油作為連續(xù)相，產(chǎn)生成對(duì)的不同液滴。兩個(gè)液滴在下游相遇并融合，Ca2+使海藻酸鈉凝膠化，形成包封細(xì)胞的凝膠微球。然而，由于交聯(lián)發(fā)生在鈣離子均勻分布之前，微凝膠的均勻性降低。此外，融合通常會(huì)導(dǎo)致最終交聯(lián)的藻酸鹽微凝膠的體積增加。

穆尼的團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種內(nèi)部凝膠化方法，使用流動(dòng)聚焦微流體裝置制備單細(xì)胞微凝膠（圖5B）。具體來(lái)說(shuō)，細(xì)胞懸浮在碳酸鈣納米顆粒溶液中，這些納米顆粒被吸附在細(xì)胞表面。在洗滌多余的納米顆粒后，將細(xì)胞懸浮液與作為分散相的海藻酸鈉溶液混合，形成油包水珠。由于油相中存在乙酸，H+擴(kuò)散釋放鈣，鈣介導(dǎo)海藻酸鈉凝膠化形成微球。盡管這種方法可以在不進(jìn)行額外下游處理的情況下顯著提高單細(xì)胞包封的效率，但只有含有細(xì)胞的液滴會(huì)被交聯(lián)，所得凝膠微球的結(jié)構(gòu)也會(huì)不均勻。為了解決凝膠微球結(jié)構(gòu)不均勻的問(wèn)題，Utech等人提出了一種使用微流控液滴技術(shù)制備具有均勻結(jié)構(gòu)的單分散海藻酸鹽微凝膠的方法（圖5C）。使用水溶性鈣絡(luò)合物作為交聯(lián)前體，可以使鈣離子在產(chǎn)生的海藻酸鹽液滴內(nèi)均勻分布。具體來(lái)說(shuō)，在將單個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞包封在液滴中后，將乙酸加入連續(xù)相中以解離復(fù)合物并釋放鈣離子，鈣離子又與海藻酸鈉反應(yīng)形成結(jié)構(gòu)均勻的海藻酸鈉微凝膠。

瓊脂糖是一種從紅藻細(xì)胞壁中提取的天然線性多糖，由β-d-半乳糖和α-3,6-半乳糖苷組成。它是一種典型的天然聚合物，在37°C的溶液中由溫度引發(fā)，然后在20°C下交聯(lián)成凝膠。瓊脂糖，特別是低熔點(diǎn)瓊脂糖，因其良好的生物相容性和溫和的凝膠化條件而適用于細(xì)胞包封實(shí)驗(yàn)。在他們的過(guò)程中，用低熔點(diǎn)瓊脂糖包封單個(gè)酵母細(xì)胞以形成瓊脂糖液滴，將其收集到放置在冰上的50mL離心管中以形成瓊脂糖微凝膠。將瓊脂糖微凝膠重新懸浮在合適的培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，形成單酵母細(xì)胞集落微凝膠，這為集落深度測(cè)序提供了足夠的RNA，并減少了單個(gè)單細(xì)胞基因表達(dá)譜中出現(xiàn)的錯(cuò)誤。

明膠是甘氨酸、脯氨酸和羥脯氨酸等氨基酸的混合物，通過(guò)皮膚、骨骼和肌腱等結(jié)締組織中膠原蛋白的降解形成。明膠也通過(guò)溫度誘導(dǎo)聚合形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。Li等人使用明膠作為水凝膠材料來(lái)包封微藻細(xì)胞（E.gracilis和C.reinhardtii）進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)和篩選。基于流式細(xì)胞術(shù)輔助分選，可以選擇具有快速生物量生產(chǎn)力或高脂質(zhì)生產(chǎn)力的培養(yǎng)的微藻單克隆群體進(jìn)行多重篩選。特別是，熱響應(yīng)性明膠可以在20-27°C的范圍內(nèi)維持細(xì)胞的液體培養(yǎng)，在4°C下發(fā)生凝膠化形成微凝膠，用于分選，當(dāng)溫度升高到35°C時(shí)，發(fā)生脫膠以有效恢復(fù)細(xì)胞。雖然整個(gè)過(guò)程不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，但復(fù)雜的凝膠化機(jī)制有一定的缺點(diǎn)，包括凝膠化時(shí)間長(zhǎng)，通常需要幾個(gè)小時(shí)才能形成中等硬度的凝膠，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)效率低。為了克服這一缺點(diǎn)，研究人員對(duì)明膠進(jìn)行了化學(xué)改性。Nan等人使用甲基丙烯酸明膠，一種光學(xué)交聯(lián)明膠，可以通過(guò)紫外線照射快速凝膠化。他們的芯片上凝膠技術(shù)與微流控液滴技術(shù)無(wú)縫結(jié)合，實(shí)現(xiàn)了凝膠微球的高通量制備。

為了更好地模擬體內(nèi)細(xì)胞的生理環(huán)境，研究人員使用多組分材料（如明膠和膠原蛋白）制備單細(xì)胞微凝膠。當(dāng)單獨(dú)用作支架時(shí)，膠原蛋白的機(jī)械性能較差，但添加明膠可以通過(guò)支持細(xì)胞粘附來(lái)改善凝膠的機(jī)械性能，同時(shí)保持膠原蛋白的調(diào)節(jié)性能。微凝膠的材料特性（剛度、孔徑、交聯(lián)度和膨脹率）可以通過(guò)改變液滴的組成和交聯(lián)時(shí)間來(lái)控制。包封的細(xì)胞存活率高度依賴于交聯(lián)時(shí)間，較長(zhǎng)的交聯(lián)時(shí)間會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞存活率降低。交聯(lián)時(shí)間為8分鐘的微凝膠中約70%的細(xì)胞能夠存活一周，表明凝膠珠的形成不會(huì)損傷細(xì)胞，并可能用于未來(lái)的單細(xì)胞分析。此外，微凝膠中的單細(xì)胞大多偏離中心。為了防止細(xì)胞逃逸并實(shí)現(xiàn)特殊的操作目的（如長(zhǎng)期細(xì)胞培養(yǎng)），Kamperman等人提出了一種微流控液滴方法，通過(guò)延遲酶交聯(lián)將單細(xì)胞定中心在由透明質(zhì)酸和葡聚糖組成的微凝膠中。這種單細(xì)胞定心實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞從微凝膠逃逸的持續(xù)預(yù)防（超過(guò)28天），大大提高了單細(xì)胞長(zhǎng)期培養(yǎng)的可靠性。

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