隨著腫瘤早期診斷及個體化治療理念的提出與發展，人們對腫瘤研究不斷深入，逐漸意識到在腫瘤診治方面，傳統腫瘤組織活檢具有一定的局限性，而液體活檢作為一種新型的獲取腫瘤信息的方式，已引起人們的極大關注。目前，用于液體活檢分析的工具很多，基于微流控技術分離和純化特異性循環腫瘤生物標志物的平臺具有通量高、靈敏度高、消耗量低、敏感度高、自動化程度高以及可控性強等特點，可作為新型有效的腫瘤診斷和預后工具。本文中，我們將集中闡述液體活檢的研究對象：循環腫瘤細胞（CTCs）、外泌體（Exosomes）和循環核酸（cNAs），并討論微流控技術在分離和純化腫瘤生物標志物中的重要應用。

1.液體活檢背景介紹

近年來，腫瘤診療技術已取得很大進步，但是癌癥依然是導致人類死亡的主要因素。癌癥轉移是造成癌癥患者死亡的重要因素，同時轉移過程相對復雜，增加了癌癥診療的困難。因此，對于癌癥，做到早期診斷、實時監測和準確預后是非常關鍵的。

目前，傳統的組織活檢方式存在很多問題，如：成本高、取樣難、創傷大等，且難以做到“早篩查、早治療”。隨著生物技術、分子技術和納米技術的發展，一系列新型技術被應用到癌癥的診療中。液體活檢作為體外診斷的前沿領域，涵蓋非侵入式取樣，檢測腫瘤或轉移灶釋放到血液中的循環腫瘤生物標志物（CTCs、Exosomes和cNAs），為監測腫瘤動態及個體化治療提供新的方式，受到人們的關注（圖1）。

圖1：癌癥的形成（A）、轉移（B）及循環腫瘤標志物的特點（C）

2.微流控技術的應用分析液體活檢背景介紹

①微流控技術概述

微流控技術是一種在微米尺寸級別下處理或操縱液體的技術手段，將混合器、執行器、反應器、分離器、傳感器等集于一體，從而優化檢測過程。其涉及到電子、機械、化學、物理和生物等多門學科，具有通量高、靈敏度高、樣本分析時間短、樣本量少、可控性強等優勢，被廣泛應用于現代分析化學、藥劑學、細胞生物學、遺傳學等諸多研究領域。也正是基于以上多種優勢，微流控技術為探索液體活檢中的循環腫瘤生物標志物檢測打開通道，為癌癥的早期診斷與治療提供新的有效手段。

②應用分類介紹

1) 循環腫瘤細胞（CTCs）檢測

循環腫瘤細胞（CTCs）是指從原發腫瘤或者轉移灶的邊緣脫落進入癌癥患者外周血循環的腫瘤細胞，其不僅攜帶了腫瘤細胞的全部基因組并且在癌癥病變早期就已經存在于外周血循環中，因此CTCs被作為癌癥研究的重要對象和癌癥早期診斷、療效評估的重要標志物，可實現實時非侵入式的監控癌癥的發展變化及治療效果。

近年來，CTCs的分離與純化技術不斷發展，但由于CTCs的腫瘤異質性及稀有性（每107-109個血液細胞中僅有1-10個CTCs），分離與純化CTCs面臨巨大挑戰。微流控技術平臺因其集成度高、設計靈活、材料通用性強和自動化程度高，被廣泛應用于CTCs的分離純化中。

目前，基于微流控技術分離CTCs的方法大致分為兩大類：無標簽技術和免疫親和技術（圖2）。前者是建立在物理性質基礎上分離目標細胞，如大小，密度，形狀，變形性和介電性能，而后者主要利用靶細胞的生化特性，通過細胞表面特異性表達的蛋白質生物標志物（主要分為anti-EpCAM正向捕獲法與anti-CD45負向富集法）分離靶細胞（圖2）。

圖2：微流控系統分離CTCs的方法

基于免疫磁珠分離富集CTCs是最常用的方法，具有高靈敏度和高特異性。美晶醫療自主研發的基于微流控技術的CTCs檢測平臺CellRichTM，可以通過癌細胞表面抗原和共軛偶聯到磁珠上的抗體間的相互作用，高效富集CTCs。當血液流經該微流體裝置時，其他血細胞在流體力學的作用下被分離出去，與免疫磁珠結合的細胞會在磁場的作用下發生偏轉進入分離富集通道，以此達到對循環腫瘤細胞分離捕獲的目的。此法與傳統的物理分離方法相比，具有較高的回收率與純化度(圖3）。

圖3：基于免疫磁珠分離CTCs的微流控系統

2) 外泌體檢測

循環腫瘤外泌體是指由腫瘤細胞分泌的具有生物活性的囊泡小體，直徑為20-300nm。不同來源的外泌體含有其獨特的脂質、RNA、DNA和蛋白質等，可直接反映細胞的來源及進展。外泌體廣泛存在于人體體液中，具有很高的豐度（每毫升血液中含有109-1012個外泌體）。因此對腫瘤來源外泌體的檢測和分析可以作為無創探究腫瘤來源與進展，進而輔助腫瘤的早期診斷和指導腫瘤治療。

近年來，外泌體作為腫瘤生物標志物成為無創活檢（液體活檢）的研究熱點，但外泌體分泌是一種動態的過程，其在體液中實時變化，且在腫瘤治療過程中也存在穩定性問題。因此，精確分離和分析外泌體仍然面臨巨大挑戰性。與傳統的外泌體分離技術如超速離心法，密度梯度離心法等相比，微流控技術在檢測自動化、集成能力、消耗時間、產物完整性、純度、回收率等方面具有很大優勢，進而有利于外泌體的下游分析應用。

目前，基于微流控技術分離純化外泌體的方法主要分為兩大類：囊泡大小（20-300nm）和表面生物標志物（如EpCAM、CD9、CD63、CD81），且各有特點。前者建立在納米多孔結構的基礎上，實現快速高效捕獲外泌體，但因外泌體的尺寸范圍在納米級別，因此對技術要求較高，且可能受到飽和限制；后者利用免疫親和原理，建立的微流控系統有抗體修飾微通道或免疫磁珠法（圖4），具有高通量、高靈敏度，然而外泌體也具有與CTCs類似的異質性，對于特定生物標志物低表達的外泌體捕獲效率不高。

圖4：基于免疫親和原理分析外泌體的微流控系統

另外，對于外泌體的研究雖發展迅速，但與CTCs相比，市場上缺乏成熟的微流控檢測系統，在液體活檢領域，外泌體的研究應用沒有CTCs廣泛和成熟。因此，為了更精準的定量和定性分析腫瘤來源外泌體，深入探究外泌體的物理與生物特性，設計結合多個功能于一體的新型微流控系統，對于分離分析外泌體是至關重要的。

3) cNAs檢測

循環核酸(cNAs)是指血液循環系統中發現的DNA和RNA片段。可以通過非侵入性手段獲取cNAs，用于分析腫瘤的遺傳信息及表觀遺傳信息。基因表達譜與腫瘤的發展及進展顯著相關。因此，cNAs作為液體活檢重要的生物標志物，可用于癌癥的早期診斷和療效評估。

鑒于現在檢測技術不成熟，限制了腫瘤標志物cNAs的臨床應用。傳統提取分析核酸的方法，如電泳結合熒光染色技術，有一定的局限性，勞動密集型和高成本，且分步操作容易導致樣品損失。微流控系統集多種技術于一體，一個設備可順序執行多個操作，如樣品制備，反應，分離，純化和分析，減少樣本損失，提高樣本純度。

因此，新型微流控系統可作為科研人員研究循環生物標志物的重要手段，亦是檢測腫瘤生物標志物的未來發展方向。但是，目前用于cNAs檢測的微流控系統，依然存在待解決的難題：a)常規提取核酸的過程是分步完成的，不能保證核酸片段的完整性，易導致分析錯誤，需要開發柔和、簡便、快捷的提取核酸方法，從而充分發揮基因圖譜分析及分子測序技術的強大功能。b)傳統的微流控系統只是單純的分離系統， cNAs分析，需借助qPCR，數字PCR和測序平臺等，而PCR方法有其內在的限制，如擴增錯誤，重復性差和擴增效率不同。

圖5：分析cNAs的微流控系統

另外，遺傳突變在不同腫瘤中的概況遠比我們所能想象的要復雜，存在嚴重的腫瘤異質性，使得通過解析cNAs輔助癌癥診療更加艱難。這要求優化現有微流控系統性能，結合基因特性，開發更多高精準、高效率、高集成度的微流控系統，從而更好地服務于液體活檢的臨床應用。

3.結語

液體活檢作為一種新型的非侵入性的樣本獲取方法，為癌癥診斷與治療提供新的方式。微流控技術因其具有高度集成化及時空操控性強等優勢，為液體活檢提供重要平臺，并吸引了科學界和生物技術產業界的極大關注。

與此同時，在臨床腫瘤診療的轉化應用上，腫瘤液體活檢依然面臨重重挑戰：

a)這三種腫瘤生物標志物的含量及其稀少，且存在腫瘤異質性，使得對其分離和純化非常困難。克服這一挑戰，需要開發充分利用腫瘤生物標志物的物理學與生物學特性相結合的微流控平臺。

b)高精準度、全自動化的基于微流控分離、純化腫瘤生物標志物的系統多處于科研階段，未被臨床廣泛應用。

c)循環腫瘤生物標志物與微流控平臺之前的關系尚需完善，為進一步推動靈敏度高、重復性好的微流控系統的開發，需在多種癌癥患者中進行大量的臨床試驗。

d)我們對腫瘤生物學的理解仍處于起步階段。隨著不斷深入研究各種循環腫瘤生物標志物在腫瘤形成和發展中的作用，更強大、更有效的商業化微流控系統將應運而生。

相信，未來，在腫瘤液體活檢及個體化診療領域，微流控技術將會發揮越來越重要的作用。

原文：

Nanjing Hao and John X.J. Zhang . Microfluidic Screening of Circulating Tumor Biomarkers toward Liquid Biopsy  Separation & Purification Reviews, Separation & Purification Reviews, 2017.

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